HAPPY PERAWAT: laporan pratikum imltd 1 isolasi dna dan pengukuran konsentrasinya

LAPORAN PRATIKUM INFEKSI

MENULAR LEWAT TRANSFUSI DARAH I (IMLTD I)

“ISOLASI DNA DAN PENGUKURAN KONSENTRASI”

$Description: C:\Users\Duniaku\Pictures\17et5s (3).jpg$

Disusun Oleh :

Kelompok 3

1. Nuroktafianti Makmur (16600035)

2. Rahmatia Toni (16600037)

3. Rizkia Anggini (16600041)

4. Suciyati Wahyuningsih (16600047)

5. Yuni Andriyani (16600055)

PROGRAM STUDI DIII TEKNOLOGI TRANSFUSI DARAH

STIKES GUNA BANGSA YOGYAKARTA

2017

A. Tujuan

1. Untuk mengetahui dan mempelajari prinsip dan tekhnik isolasi DNA

2. Mengetahui tingkat kosentrasi DNA dengan panjang gelombang tertentu

B. Landasan Teori

DNA (deoxyribonucleid acid) adalah master molekul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang di butuhkan untk proses metabolism dalam setiap organisme (Corkill, G., Rapley, R, 2008). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999).

Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nucleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua “benang” polinukelotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hydrogen dan antara nukleotida yang dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat didalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai “cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Corkill, G., Rapley, R, 2008).

$Description: C:\Users\Duniaku\Pictures\DNA.png$

Gambar 1. Struktur DNA

Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA (deoxyribonucleid acid ) adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel. Tetapi ada pula DNA yang terdapat di mitokondria, oleh karena itu disebut DNA mitokondria. Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik. Artinya, DNAmenyimpan cetak biru bagi segala aktifitas sel. Dan ini berlaku umum bagi setiaporganisme (Anonim, 2011).

Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati, 2011).

Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible), spektrofotometri UV (ultra violet), Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi, 2009).

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi,2009).

C. Metode

Alat :

1. Mikropipet

2. Sentrifugasi

3. Waterbath

4. Lemari pendingin

5. Spektrofotometer

6. Mocrowave Oven

Bahan :

1. Handscoon/ Glove

2. Masker

3. Sampel darah vena

4. RBC lysis buffer

5. GB buffer

6. EB (Elution buffer)

7. Etanol absolute dingin

8. W1 buffer

9. Wash buffer

10. Yellow tip, Blue tip dan White tip

11. GD kolom

12. Collection tube

13. Tabung Conical

14. Microtube

Cara kerja:

Sampel ditambah kembali dengan 100 ul RBC lysis buffer sambil diresurspensi dengan pippeting

sampel ditambah 200 ul GB buffer dan dikocok kuat

Sampel diinkubasi pada suhu 60^ₒC selama 15 menit, dan diinversi setiap 5 menit sakli. Selain itu, elution buffer disiapkan dengan dipanaskan pada suhu 60 ^ₒC dalam waterbath

Sampel DNA yang terelusi disimpan pada suhu -20 deratjat celcius, kemudian dilakukan pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometer ( kuanitaif) dan integritas DNA (kualitatif) dengan elektrofoesi gel agarosa

D. Hasil

Table hasil isolasi DNA

No	Sample	Kelompok	Hasil Percobaan	Perubahan Warna
1. 2.	Yuni Andriyani Nuroktafianti Makmur	III A III B	Percobaan I Sample dipindahkan kedalam GD kolom yang terpasang pada collction tube, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit	Hitam atau Keruh
			Percobaan II Sample ditambahkan 400 ul W1 buffer dan disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit	Kuning
			Percobaan III Sample ditambahkan 600 ul Wash buffer dan disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit	Putih bersih atau bening

Hasil kemurnian dan konsentrasi DNA menggunakan alat Spektrofotometer

Dengan interpretasihasil sebagai berikut:

Rumus :

· Konsentrasi DNA : A260 X 50 X factor pengenceran = … ng/ul

· Kemurnian DNA : A260/A280 (*kemurnian DNA yang baik 1.8-2)

>2 terjadi kontaminasi RNA

<1,8 terjadi kontaminasi protein

1. Sample Yuni Anriyani

· Panjang gelombang = 230, 260, 280

A230 = 0.069, A260 = 0.134, A280 =0.074

A260/A230 = 0.035, A260/A280 = 1.887 (kemurnian baik)

Hasil konsentrasi = 6.74 (ng/ul)

2. Sample Nuroktafianti Makmur

· Panjang gelombang = 230, 260, 280

A230 = 0.232, A260 = 0.481, A280 = 0.233

A260/A230 = 2.071, A260/A280 = 2.063 (kemurnian baik)

Hasil kosentrasi = 24.07 (ng/ul)

$Description: C:\Users\Duniaku\AppData\Local\Microsoft\Windows\Temporary Internet Files\Content.Word\IMG_20171129_223415.jpg$

Gambar 2. Hasil kemurnian dan konsentrasi DNA

E. Pembahasan

Pada praktikum kali ini kami akan membahas tentang isolasi DNA dan konsentrasi DNA. DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetic dan berfungsi untuk mengatur perkambangan biologis seluruh bentuk kehidupan secera seluler. DNA terdapat pada nucleus,mitokondria dan kloroplas. Perbedaan diantara ketiganya adalah : DNA nukleus berbentuk liner dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon,sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon,DNA ini hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Berbeda dengan DNA nucleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua.

Jika dilihat dari organismenya,struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA iokariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular sedangkan DNA iokariot berbentuk linear dan memiliki protein histon.

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-komponennya,yaitu gula pentosa (deoksiribosa),gugus fosfat,dan pasangan basah. Pasangan basah pada DNA terdiri atas 2 macam,yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenine (A) dan guanine (G) yang memiliki struktur cincin ganda,sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin tunggal.

DNA juga dapat diisolasi,baik pada maupun pada tumbuhan. Prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada dua yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul sehingga substansi yang lebih berat akan berada didasar dan yang lebih ringan terletak diatas.

Tahap pertama isolasi DNA yaitu melisiskan dinding dan membrane sel (sel lisis buffer,diputar bolak balik 5-6 kali untuk homogennasi. Setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Selanjutnya disintrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm sentrifugasi ini bertujuan untuk memisahkan bagian sel dengan sitoplasma. Selanjutnya supernatant yang terbentuk dibuang.

Tahap selanjutnya yaitu proses menghilangkan kontaminasi DNA dengan cara sampel yang telah diinkubasi dengan tambahan ethanol apsolut dingin dipindahkan kedalam GD kolom yang terpasang pada collection tube setelah disintrifugasi selama 5 menit akan beruabah warna menjadi hitam atau keruh. Lakukan flow through dibagian collection tube dibuang lalu dipasang kembali dan ditambah W1 buffer kemudian disentrifugasi selama 1 menit warna akan berubah menjadi kuning bertanda kontaminasi DNA semakin sedikit. Lakukan flow through kembali dan ditambah wash buffer kemudian disentrifugasi selama satu menit dan warna akan berubah menjadi putih bersih menandakan bahwa kontaminasi DNA sudah hilang.

Tahap selanjutnya menghilangkan buffer terakhir dengan cara flow through kembali collection tube lalu dipasangkan kembali kemudian sampel disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya collection tube dibuang dan GD kolom dipasangkan pada tabung 1,5 ml dan ditambah Elution buffer (yang telah dipanaskan) lalu diinkubasi selama 5 menit kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit. Sample DNA disimpan pada suhu -20^ₒC lalu dilakukan pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometer (kuantitatif).

F. Kesimpulan

1. Isolasi DNA menggunakan prinsip Chromatografi Adsorbsi yaitu menjebak Dna pada membrane silika. Dengan tahapan sebagai berikut : pelisisan membrane (dinding sel), ekstrasi DNA, presipitasi DNA, pemurnian DNA dan pengawetan DNA.

2. Tingkat konsentrasi DNA dengan panjang gelombang 230, 260, dan 280 dengan hasil sample pertama konsentrasinya 6.74 (ng/ul), dan sample kedua konsentrasinya 24.07 (ng/ul) dengan hasil kemurnian yang baik antara 1.8-2.